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范围与规范性引用文件

本作业指导书适用于常温聚焦离子束-扫描电镜（ FIB-SEM ）对细胞、动植物组织、微生物等生物样品进行三维成像的全过程。操作需遵循GB/T 47187—2026《微束分析 体电子显微术 生物样品的聚焦离子束-扫描电镜三维成像方法》及引用的相关标准。

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术语与定义

操作前需明确以下关键术语：

术语	定义
体电子显微术（vEM）	通过对样品进行连续超薄切削并采集序列电镜图像，进行三维重构以获取样品内部三维结构信息的技术。
聚焦离子束-扫描电镜（FIB-SEM）	兼具聚焦离子束加工与扫描电子显微成像功能的微纳加工与成像仪器。
离子束切削/刻蚀	采用高能离子束轰击试样表面，溅射出原子以形成新表面的过程。
背散射电子（BSE）成像	利用背散射电子探测器接收信号，形成反映样品成分衬度的二维图像。

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原理概述

本方法基于离子束切削与背散射电子成像的循环：

1. 高能聚焦离子束按设定厚度切削样品表面。
2. 低加速电压电子束对暴露的新鲜表面进行扫描， 背散射电子探测器 采集超微结构二维图像。
3. 重复步骤1和2，获得序列二维图像。
4. 通过计算机软件对序列图像进行对中、降噪、分割和渲染，实现三维重构。

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仪器美利体育官网首页网址、试剂与环境要求

美利体育登录入口官网:5.1 主要仪器美利体育官网首页网址

• 聚焦离子束-扫描电镜（FIB-SEM） ：需具备自动序列切削成像功能，切削步距小于10nm，背散射电子像分辨率（≤5kV时）高于5nm。
• 辅助美利体育官网首页网址：离子溅射仪、切片修块机、包埋聚合箱、高速离心机、体视显微镜等。

美利体育登录入口官网:5.2 关键试剂与材料

• 固定剂：戊二醛、四氧化锇。
• 染色剂：硫代对二氨基脲（TCH）、乙酸双氧铀、天冬氨酸铅。
• 包埋剂：Epon812类环氧树脂包埋剂。
• 其他：磷酸缓冲液、乙醇、丙酮、导电胶、前驱气体（如铂源、碳源）。

美利体育登录入口官网:5.3 环境及试验条件

实验室环境温度应保持在20℃±2℃，相对湿度小于60%。电源稳定，仪器接地良好，周围杂散磁场强度不超过3.5×10?? T。

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样品制备标准流程（OTO法）

生物样品需经过固定、染色、包埋等一系列处理，具体步骤如下：

步骤	操作内容	关键参数与注意事项
6.3.1 前固定	样品在2.5%戊二醛固定液中4℃浸渍固定≥24h。	使用0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）漂洗3次，每次10min。
6.3.2 后固定第一步	样品在四氧化锇-亚铁氰化钾混合液中冰上孵育1h。	现配现用，双蒸馏水漂洗3次。
6.3.3 后固定第二步	依次用1% TCH溶液和2%四氧化锇处理。	TCH溶液需避光，现配现用。
6.3.4 块染	依次用乙酸双氧铀（4℃，≥12h）和天冬氨酸铅（60℃，30min）染色。	染色后充分漂洗，避免染色剂残留。
6.3.5 脱水	乙醇梯度脱水（30%，50%，70%，90%，100%×2），每级20min，后换丙酮。	确保完全脱水，避免影响树脂渗透。
6.3.6 包埋剂渗透	包埋剂与丙酮混合液梯度渗透，最后纯包埋剂渗透两次。	总渗透时间约2天，确保树脂充分渗透样品。
6.3.7 包埋与聚合	将样品置入包埋板，60℃聚合固化48h。	根据成像需要对样品进行整姿定位。
6.3.8 修块	用修块机修整包埋块，暴露目标区域。	暴露的样品尺寸不宜超过1mm×1mm×1mm。
6.3.9 喷镀导电膜	用离子溅射仪对包埋块喷镀导电膜。	膜厚不低于50nm，确保样品导电性。

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FIB-SEM序列图像采集操作流程

美利体育登录入口官网:7.1 前期准备

1. 仪器状态检查：检查真空度、灯丝束流、气体系统、冷却水等是否正常。
2. 镜筒合轴检查：检查并调整离子束与电子束光路合轴，确保图像无漂移。
3. 前驱气体源检查：开启气体注入系统（GIS），检查各气体源温度与控制。

美利体育登录入口官网:7.2 试验步骤

步骤编号	操作内容	关键参数与设置
7.2.1	安装试样	将喷镀后的包埋块试样用导电胶粘贴在样品托（如45°预倾台）上，装入样品室抽真空。
7.2.2	共聚焦位置设定	倾转样品台使切削面与离子束垂直，调整Z轴高度，使离子束与电子束图像中心对同一特征点。
7.2.3	工作条件设定	离子束束流：0.1pA~2μA，加速电压30kV；电子枪加速电压：0.5kV~5kV。
7.2.4	上表面预抛光	用9nA~65nA大束流切削上表面约2μm，面积70μm~100μm，获得平整起始面。
7.2.5	目标结构定位	倾转样品台至电子束成像位置（如+45°），在低电压BSE模式下成像，定位并测量目标结构位置。
7.2.6	离子束诱导沉积与标记	使用GIS注入前驱气体（如铂），在目标区域进行离子束诱导沉积作为保护层。随后用小束流（230pA~2.5nA）刻蚀“×”形图案作为漂移校正标记。
7.2.7	离子束粗切修块	在沉积区域两侧用大束流刻蚀出梯形凹槽（宽10μm~15μm，深15μm~25μm），为成像区域创造空间。
7.2.8	二次沉积与标记	旋转样品台180°，在电子束成像面同样进行气体沉积并刻蚀“○”形等图案作为拍照漂移矫正标记。
7.2.9	细切	用小束流（230pA~2.5nA）对目标截面表面进行精细抛光，直至获得平滑平面。
7.2.10	序列采集参数设置	在三维采集软件中设置：切削厚度（步距）、图像尺寸（≤8K）、驻留时间（1μs~2μs）、自动聚焦参数（5-10次）等。
7.2.11	自动序列采集	启动自动程序，循环执行“离子束切削一层 → 电子束扫描成像一帧”。
7.2.12	质量美利体育登录入口官网	采集过程中间歇性检查图像质量、目标位置、是否有帘幕效应等，发现问题及时调整。

美利体育登录入口官网:7.2.13 数据质量缺陷处理

• 不良图像剔除与矫正：手动剔除条纹等不良图像，并用软件插值补充。对亮度衬度异常的连续图像进行单独矫正。
• 图像漂移校正：采用最小二乘法等算法消除序列图像在X、Y方向的漂移。
• 帘幕效应消除：如出现条纹状帘幕效应，采用快速傅里叶变换滤波等方法消除。

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图像数据的三维重构

使用专业三维重构软件（如Amira, IMOD, Dragonfly等）按以下流程处理：

1. 图像对中与配准：基于标记物或图像特征，将序列二维图像进行精确对中。
2. 图像降噪：应用滤波器减少图像噪声，提高信噪比。
3. 结构分割：根据灰度、纹理等特征，手动或（半）自动识别并分割目标结构（如细胞、细胞器）。
4. 三维渲染与可视化：对分割后的结构进行三维重建、渲染，生成可交互操作的三维模型，展示其形态与空间关系。

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结果报告

实验完成后，报告应至少包含以下内容：报告编号、样品与委托单位信息、接收日期、实验室名称与地址、所用 仪器美利体育官网首页网址 信息、环境条件、美利体育登录入口官网依据（GB/T 47187—2026）、制样方法、美利体育登录入口官网结果（可附代表性图像）、美利体育登录入口官网人、：巳、批准人及报告日期。