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重链QVQLQQPGAE LVKIGASVKM SCKASGYTFT' SYNM-WVKQT40 PGRGLEWIGA IYTGNGDISY NQKFKGKATL TADKSSSTAY 8 MQ1.SSLTSED SAVYYCARST YYGGDWYFNV WGAGTTVTVS 120 AASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV 160 SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ 200 TYICNVNHKP SNTKVDKKAE PKSCDKTHTC PPCPAPELLG 240 GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN 280 WYVDGVEVHN AKIKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG 320 KEYKCKVSNK ALPAPIEKT1 SKAKGQPREP QVYTLPPSRD 360 ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYK TTPP 400 VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY 440 TQKSLSLSPG K 451## 轻链QIVLSQSPAI LSASPGEKVT MTCRASSSVS YIHWFQQKPG 10 SSPKPWIYAT SNLASGVPVR FSGSGSGTSY SLTISRVEAE 80 DAATYYCQQW TSNPPTFGGG TKLEIKRTVA APSVFIFPPS 120 DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE 160 SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL 200 SSPVTKSFNR GEC 213## 二硫键重链链内 22-96148-204 265-325 371-42922"-96"148"-204" 265"-325"371"-429"轻链链内23'-87'133'-193'23\*-S7"133"-193"重轻链间 224-213'224"-213"重链链间236-230"233-233"N-糖基化位点301、301"分子式C642eHaoN:opO20usS（不含糖基部分）分子量144508.41（不含糖基部分）本品系由高效表达利妥昔单抗基因的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，经细胞培养和分离纯化后获得的利妥昔单抗制成的无菌溶液。不含抑菌剂和抗生素。

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2.1工程细胞
2.1.1名称及来源
利妥苷单抗工程细胞株系由含抗CD20人/鼠嵌合单克隆抗体基因的质粒转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞构建而成。
2.1.2细胞库建立、传代及保存
原始细胞传代、扩增后保存于液氮中，作为主细胞库；从主细胞库的细胞传代，扩增后保存于液氮中，作为I作细胞库，各级细胞库细胞传代应不超过批准的代次，细胞库检定合格后方可用于生产。
2.1.3主细胞库及工作细胞库的检定
应符合生物制品生产用动物细胞基质制备及质量控制（通则0234）规定。
2.2原液
2.2.1细胞的复苏与扩增
从工作细胞库来源的细胞复苏后、进行传代、扩增，供生物反应器接种用。
2.2.2生产用细胞培养液
生产用细胞培养液应不含血清和抗生素，
2.2.3细胞培养
采用经批准的工艺进行培养细胞，收集含有目的产物的培养液，即“收获液"。细胞培养全过程应严格按照无菌操作。
2.2.4分离纯化
收获液采用经批准的T.艺进行纯化、病毒消除并调整至目标浓度，过滤，即为利妥昔单抗原液，如需存放，应规定保存温度和时间，
2.2.5原液检定
按3.1项进行。
2.3成品
2.3.1分批
应符合生物制品分包装及贮运管理（通则0239）项下有关规定。
2.3.2分装
应符合生物制品分包装及贮运管理（通则0239）与注射剂（通则0102）项下有关规定。
2.3.3规格
同批准的规格。
2.3.4包装
应符合生物制品分包装及贮运管理（通则0239）与注射剂（通则0102）项下有关规定。
2.3.5成品检定
按3.2项进行：

3.1原液检定
3.1.1鉴别
3.1.1.1肽图
照肽图检查法（通则3405）测定。
试剂（1）三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris缓冲液）取三羟甲基氨基甲烷12.1g，加水使溶解并稀释至90ml，用盐酸调pH至8.0，用水稀释至100ml，摇匀，
（2）二硫苏糖醇溶液取二硫苏糖醇15.4g：加水使溶解并稀释至100ml，摇匀，
（3）盐酸胍溶液取7.64g盐酸胍，加水至10ml，摇匀。
（4）变性溶液取盐酸胍溶液1ml，加Tris缓冲液50μl和二硫苏糖醇溶液10μl，混匀。
（5）碘乙酰胺溶液取碘乙酰胺1.85g，加水使溶解并稀释至10ml，摇匀。
（6）赖氨酸内切酶溶液（Lys-C酶溶液）取Lys-C酶1支，自上而下缓慢加50mmol/L醋酸溶液40μl至瓶底，混匀，制成每1ml含Lys-C酶0.5mg的溶液；或按Lys-C酶说明书操作，
供试品溶液取本品适量（相当于约含利妥昔单抗0.8mg)，置1.5ml离心管中，37℃真空离心浓缩至内容物为透明状，加变性溶液40μl，涡旋约2分钟使蛋白质溶解，37℃水浴1小时后短暂离心，加碘乙酰胺溶液1μl,混匀后再次短暂离心，室温避光放置30分钟。加Tris缓冲液760μl，涡旋30秒混匀，取上述溶液100μl，加LysC酶溶液5μl，混匀，37℃水浴4小时，加甲酸3μl终止反应，10000g离心5分钟，取上清液，
对照品溶液取利妥背单抗对照品约0.8mg·照供试品溶液同法制备。
空白溶液照制剂配方配制不含利妥昔单抗的溶液，取适量，照供试品溶液同法制备。
色谱条件用耐酸的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（2.1mm×150mm，1.7μm），柱温60℃：以含0.1%甲酸0.02%三氟乙酸的水溶液为流动相A，含0.08%甲酸-0.02%三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱，流速每分钟0.3ml：美利体育登录入口官网波长214nm；样品盘温度为6℃：进样体积10μl。
时间（分钟）流动相A（%）流动相B（%）
0 98 2
5 98 2
120 65 35
120.1 = 100
128 0 100
128. 1 98 2
135 98 2
测定法精密量取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
结果判定供试品溶液的肽图谱应与对照品溶液的肽图谱一致。
3.1.1.2等电点
照单抗电荷变异体测定法（通则3129）任选一法测定。
结果判定供试品溶液图谱应与对照品溶液图谱一 致，供试品溶液主峰等电点与对照品溶液主峰等电点差 异应不大于0.2。
3.1.2检查
3.1.2.1 pH值
取本品，依法检查（通则0631），应符合批准的要求：
3.1.2.2渗透压摩尔浓度
取本品，依法检查（通则0632），应符合批准的要求。
3.1.2.3纯度与杂质
（1）分子排阻色谱法
照单抗分子大小变异体测定法（通则3127第二法）测定。
对照品溶液取利妥昔单抗对照品，加流动相使溶解并稀释成每1ml约含10mg的溶液。
限度利妥昔单抗含量应不低于95.0%，聚体含量应不大于5.0%。
（2）离子交换色谱法
照高效液相色谱法（通则0512）测定。
供试品溶液取供试品，用流动相A稀释制成每1ml约含利妥背单抗lmg的溶液，取1ml，加1mg/ml羧肽酶B溶液10μl，混匀，37℃水浴30分钟。
对照品溶液取利妥昔单抗对照品，照供试品溶液同法制备。
空白溶液照制剂配方配制不含利妥昔单抗的溶液，取适量，照供试品溶液同法制备。
色谱条件以羧酸基为固定相的弱阳离子交换柱（4mmX250mm，10μm），柱温为30℃：以 20mmol/L吗啉乙磺酸（MES）溶液（用氢氧化钠溶液调pH至6.5）为流动相A，含150mmol/L氯化钠的20mmol/LMES溶液（用氢氧化钠溶液调pH至6.5）为流动相B，按下表进行梯度洗脱，流速为每分钟1ml：美利体育登录入口官网波长为280nm：样品盘温度为4℃；进样体积50μl。
时间（分钟！流动相A（%）流动相B（%）
C 65 35
20 20 801
21 n 100
23 U 100
24 R5 35
30 65 35
系统适用性要求空白溶液色谱图在目标峰位置应无干扰峰：对照品溶液色谱图中，理论板数按利妥昔单抗主峰计应不低于7000．利妥昔单抗主峰面积的相对标准偏差（n≥5）应不大于3.0%。
测定法精密量取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，利妥昔单抗峰前的色谱峰视为酸性组分峰。按面积归一化法计算利妥昔单抗和酸性组分含量。
限度利妥昔单抗主峰含量应不低于55.0%，酸性组分含量应不大于32.0%。
（3）非还原毛细管电泳法
取本品，照单抗分子大小变异体测定法（通则3127第一法）检查：
限度利妥昔单抗峰的修正峰面积应不小于总修正峰面积的90.0％，
（4）还原毛细管电泳法
取本品，照单抗分子大小变异体测定法（通则3127第一法）检查。
限度利妥肯单抗的重链（HC）和轻链（LC）的修正峰面积之和应不小于总修正峰面积的95.0%，非糖基化重链的修正峰面积应不大于总修正峰面积的2.0%。
3.1.2.4 N糖谱
取本品，依法检查（通则3130第一法)：对照品溶液照供试品溶液同法制备，应符合批准的要求。
3.1.2.5聚山梨酯80含量
取本品，依法检查（通则3203第二法)，应符合批准的要求。
3.1.2.6宿主细胞蛋白质残留量
取本品，依法检查（通则3429)，用经验证的酶联免疫吸附法测定，每1mg利妥昔单抗中宿主细胞蛋白质残留量应不高于100ng。
3.1.2.7蛋白质A残留量
取本品，依法检查（通则3429），用经验证的酶联免疫吸附法测定。每1mg利妥昔单抗中蛋白质A残留量应不高于100ng,
3.1.2.8 外源性DNA残留量
取本品：依法检查（通则3407第三法）。每1mg利妥昔单抗中外源性DNA残留量应不高于10pg。
3.1.2.9细菌内毒素
取本品，依法检查（通则1143），每1ml含内毒素的量应不大于1.0EU，
3.1.2.10微生物限度
取本品，依法检查（通则1105），每10ml供试品中需氧菌总数不得过1CFU，霉菌和酵母菌总数不得过 1CFU.
3.1.3生物学活性
取本品，依法测定（通则3542），应为标准品的80%~120%,
3.1.4含量测定
照蛋白质含量测定法（通则0731第六法）测定。
空白溶液照制剂配方配制不含利妥昔单抗的溶液。
供试品溶液取本品，精密量取适量，用空白溶液定量稀释制成每1ml约含利妥昔单抗0.5mg的溶液。
测定法取供试品溶液，以空白溶液作为空白，在230～500nm测定紫外光谱，确定最大吸收波长，测定供试品溶液在最大吸收波长和320nm波长处的吸光度。按下式计算供试品中利妥昔单抗蛋白质含量。
$$
\widetilde { \Xi } \stackrel { \star } { \mapsto } | \widetilde { \cal J } _ { \varepsilon } ^ { \star } \widehat { \Xi } \stackrel { \star } { \star } \widehat { \Xi } | | \mathrm { \normalfont ~ m } g / \mathrm { \normalfont ~ m } | ) = \frac { ( A _ { \mathrm { m a x } } - A _ { 3 2 \mathrm { i } } ) \times n } { E ^ { \star } \times L }
$$
式中 $\mathbf { A } _ { \mathfrak { m } : \kappa }$ 为最大吸光度；
$\Lambda _ { i 2 } ,$ 为供试品溶液在波长320nm处的吸光度；
n为稀释倍数；
E为批准的利妥昔单抗吸收系数：
L为光程（cm）。
限度应符合批准的要求。
3.2成品检定
3.2.1外观
应为无色至淡黄色的澄清液体。
3.2.2鉴别
3.2.2.1肽图
取本品，照3.1.1.1项测定。供试品溶液的肽图谱应与对照品溶液的肽图谱一致。
3.2.2.2等电点
照单抗电荷变异体测定法（通则3129），任选～-法测定。供试品溶液图谱应与对照品溶液图谱一致，供试品溶液主峰等电点与对照品溶液主峰等电点差异应不大于0.2.
3.2.3检查
3.2.3.1 pH值
取本品，依法检查（通则0631），应符合批准的要求.
3.2.3.2渗透压摩尔浓度
取本品，依法检查（通则0632)，应符合批准的要求。
3.2.3.3装量
取本品，依法检查（通则0102），应符合规定。
3.2.3.4不溶性微粒
取本品，依法检查（通则0903第一法)，应符合规定。
3.2.3.5可见异物
取本品，依法检查（通则0904），应符合规定，
3.2.3.6纯度与杂质
（1）分子排阻色谱法
照3.1.2.3（1）项下检查。
限度利妥皆单抗含敏应不低于95.0%，聚体含量应不大于5.0%，
（2）离子交换色谱法
取本品，照3.1.2.3（2）项下方法检查：
限度利妥青单抗主峰含最应不低于55.0%，酸性组分含量应不大于32.0%。
（3）非还原毛细管电泳法
取供试品，照单抗分子大小变异体测定法（通则3127第一法）检查。
限度利妥肯单抗主峰的修正峰面积应不小于总修正峰面积的90.0%。
（4）还原毛细管电泳法
取供试品，照单抗分子大小变异体测定法（通则3127第--法）检查。
限度利妥昔单抗的重链（HC）和轻链（LC）的修正峰面积之和应不小于总修正峰面积的95.0%，非糖基化重链的修正峰面积应不大于总修正峰面积的2.0%.
3.2.3.7聚山梨酯80含量
取本品，依法检查（通则3203第二法），应符合批准的要求。
3.2.3.8细菌内毒素
取本品，依法检查（通则1143），每1mi含内毒素的量应不高于1.0EU,
3.2.3.9无菌
取本品，依法检查（通则1101薄膜过滤法），应符台规定。
3.2.3.10异常毒性
取本品、依法检查（通则1141小鼠试验法），应符合规定。
3.2.4生物学活性
取本品，依法测定（通则3542），应为标准品的80%～120%。
3.2.5含量测定
取本品，照3.1.4项下的方法测定并计算利妥昔单抗含量，
限度应为标示量的92%～108%.

于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。

应符合生物制品分包装及贮运管理（通则0239）规定和批准的内容。