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本品系用I型和Ⅱ型肾综合征出血热（简称出血热）病毒分別接种原代地鼠肾细胞，经培养、收获病毒液，病毒灭活、纯化，混合后加人氢氧化铝佐剂制成，用于预防I型和Ⅱ型肾综合征出血热。

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2制造

2.1生产用细胞

生产用细胞为原代地鼠肾细胞。

2.1.1细胞管理及检定

应符合生物制品生产用动物细胞基质制备及质量控制（通则0234）规定。

2.1.2细胞制备

选用12～14日龄的地鼠，无菌取肾，剪碎，经消化，用培养液分散细胞，制备成细胞悬液，置适宜温度下培养成致密单层细胞。来源于同一批地鼠、同一容器内消化制备的地鼠肾细胞为一个细胞消化批；源自同一批地鼠，于同一天制备的多个细胞消化批为一个细胞批。

2.2毒种

2.2.1名称及来源

生产用毒株为I型出血热病毒PS-6株和Ⅱ型出血热病毒L株，或经批准的其他适应地鼠肾细胞的Ⅰ型和Ⅱ型出血热毒株。

2.2.2种子批的建立

应符合生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制（通则0233）规定。

I型和Ⅱ型出血热病毒分別接种原代地鼠肾细胞制备原始种子、主种子批和工作种子批、PS-6株原始种子为第5代，主种子批应不超过第8代，工作种子批应不超过第10代．生产的疫茵应不超过第11代；Lg株原始种子为第13代，主种子批I株应不超过第16代，工作种子批应不超过第18代，生产的疫苗应不超过第19代。

2.2.3种子批毒种的检定

主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应至少进行2.2.3.1～2.2.3.5项检定。

2.2.3.1鉴别试验

将各型毒种做10倍系列稀释，每个稀释度分别与已知相应型别的出血热病毒免疫血清参考品和阴性兔血清等量混合．置37℃水浴90 分钟，接种于单层Vero-E,细胞或地鼠肾细胞，于适宜条件下培养，观察10～14天。以免疫荧光法测定，中和指数应大于1000。同时设病毒阳性对照、细胞阴性对照。

2.2.3.2病毒滴定

将各型毒种做10倍系列稀释，接种地鼠肾细胞，于33℃培养10～12天，用免疫荧光法测定，主种子批病毒滴度应不低于 $7 . 5 l _ { 8 } C C I D _ { 5 0 } / \\mathrm { m l }$ ，工作种子批病毒滴度应不低于7.OIgCCID/ml。

2.2.3.3无菌检查

依法检查（通则1101），应符合规定：

2.2.3.4分枝杆菌检查

以草分枝杆菌（CMCC95024）或牛分枝杆菌菌株BCG作为阳性对照菌。取阳性对照菌接种于罗氏固体培养基，于37℃培养3～5天收集培养物，以0.9%氯化钠溶液制成菌悬液，采用细菌浊度法确定菌含盘，该菌液浊度与中国细菌浊度标准一致时活菌危约为2×10CFU/ml。稀释菌悬液，取不高于100CFU的菌液作为阳性对照。

供试品小于1ml时采用直接接种法，将供试品全部接种于适宜固体培养基（如罗氏培养基或Middlebrook7H10培养基），每种培养基做3个重复；并同时设置阳性对照。将接种后的培养基置于37℃培养56天，阳性对照应有菌生长，接种供试品的培养基未见分枝杆菌生长，则判为合格。

供试品大于1ml时采用薄膜过滤法集菌后接种培养基。将供试品以0.22μm滤膜过滤后，取滤膜接种于适宜固体培养基，同时设阳性对照。所用培养基，培养时间及结果判定同上。

2.2.3.5支原体检查

依法检查（通则3301)，应符合规定，

2.2.3.6外源病毒因子检查

依法检查（通则3302），应符合规定，

2.2.3.7免疫原性检查

取主种子批毒种制备双价疫苗，接种体重为2kg左右的白色家兔4只（家兔出血热病毒抗体应为阴性），免疫2次，间隔14天，每只后肢肌内注射1.0ml，第1次免疫后4周采血分离血清，用蚀斑减少中和试验测中和抗体，中和用病毒为出血热病毒76-118株和UR株；同时用参考血清作对照（参考血清应符合规定），4只家兔的1型和Ⅱ型出血热病毒中和抗体滴度均应不低于1 : 10.

2.2.4毒种保存

种子批毒种应于-60℃以下保存。

2.3单价原液

2.3.1细胞制备

按2.1.2项进行，

2.3.2培养液

采用适宜的培养液进行培养。如培养液含新生牛血清，其质量应符合要求（通则3604）。

2.3.3对照细胞外源病毒因子检查

依法检查（通则3302），应符合规定.

2.3.4病毒接种和培养

当细胞培养成致密单层后，将出血热病毒【型和Ⅱ型毒种分别接种细胞进行培养，病毒接种及培养条件按批准的执行。

2.3.5病毒收获

培养适宜天数后，收获病毒液。根据细胞生长情况，可换以维持液继续培养，进行多次病毒收获，检定合格的同一细胞批生产的同一次病毒收获液可合并为单次病毒收获液。

2.3.6单次病毒收获液保存

于2～8℃保存不超过30天。

2.3.7病毒灭活

单次病毒收获液加入甲醛灭活病毒，具体工艺参数，包括收获液蛋白质含量和甲醛浓度等按批准的执行。病毒灭活到期后，每个病毒灭活容器应立即取样，分别进行病毒灭活验证试验。

2.3.8病毒灭活验证试验

按灭活后的单次病毒收获液总量的0.1%抽取供试品。透析后接种地鼠肾细胞，连续盲传3代，每10～14天为1代，每代用免疫荧光法检查病毒抗原，结果均应为阴性。

2.3.9合并、离心、超滤浓缩

检定合格的同一细胞批生产的单次病毒收获液可合并为单价病毒收获液。经离心去除细胞碎片后，进行适当倍数的超滤浓缩至规定的蛋白质含量范围。

2.3.10纯化

采用柱色谱法或其他适宜的方法将浓缩后的单价病毒收获液进行纯化。

2.3.11除菌过滤

纯化后的单价病毒收获液经除菌过滤后，即为单价原液。

2.3.12单价原液检定

按3.2项进行。

2.3.13单价原液保存

于2～8℃保存不超过90天。

2.4半成品

2.4.1配制

将I型和Ⅱ型出血热病毒单价原液分别按抗原含量为1：128稀释后等量混合，且各型总蛋白质含量应不超过40μg/剂，加人适宜的稳定剂和适量的氢氧化铝佐剂后，即为半成品。

2.4.2半成品检定

按3.3项进行：

2.5成品

2.5.1分批

应符合生物制品分包装及贮运管理（通则0239）规定。

2.5.2分装

应符合生物制品分包装及贮运管理（通则0239）规定，

2.5.3规格

每瓶为1.0ml。每1次人用剂量为1.0ml。

2.5.4包装

应符合生物制品分包装及贮运管理（通则0239）规定。

3检定

3.1单次病毒收获液检定

3.1.1无菌检查

依法检查（通则1101）。应符合规定.

3.1.2支原体检查

依法检查（通则3301），应符合规定.

3.1.3病毒滴定

按2.2.3.2项进行病毒滴定。各型单次病毒收获液的病毒滴度应不低于6.5lgCCIDs/ml.

3.1.4抗原含量

采用酶联免疫吸附法（通则3429），应不低于1：64。

3.2单价原液检定

3.2.1无菌检查

依法检查（通则1101）．应符合规定。

3.2.2抗原含量

采用酶联免疫吸附法（通则3429），应不低于1：512.

3.2.3蛋白质含量

应不高于80μg/ml（通则0731第二法）。

3.2.4牛血清白蛋白残留量

应不高于50ng/ml（通则3411）。

3.2.5地鼠肾细胞蛋白质残留量

采用酶联免疫吸附法（通则3429)，应不高于12μg/剂。

3.3半成品检定

无菌检查

依法检查（通则1101），应符合规定，

3.4成品检定

3.4.1鉴别试验

可选择下列方法进行鉴别试验。

3.4.1.1效价测定

按2.2.3.7项进行，效力测定符合规定，鉴别试验判为合格。效价测定不合格，采用RT-PCR方法进行鉴别试验，

3.4.1.2 RT-PCR方法

可采用商业试剂盒进行，按试剂盒要求操作。阳性对照为Ⅰ型和型阳性质粒，空白对照为无菌（注射用）水。

引物序列为：

HTNF1: 5'- ATAACAACGATGGCAACTATGGAG - 3' ;

HTNR1: 5'-CTCATCTGGATCCTTTTCATATTGT-3' :

SEOF1: 5'-GCACTGCATGATCGGGAGAGT-3' ;

SEOR1: 5'-ATCCTGTCGGCAAGTTGGC-3'

探针序列为：

$$

\\mathrm { { \\sf H T N P } _ { : } \\mathrm { { \\sf ~ 5 ^ { ' } { \\cdot } F A M \\ A T A G C C A G G C A G A A G G \\mathrm { { \\it ~ M G B } \\mathrm { { \\bf ~ 3 ^ { ' } \\mathrm { { \\bf ~ i } } } } } } } }

$$

SEOP: 5'-HEX-TCGCAGCTTCAATACAA -MGB-3',

样品、阳性对照和空白对照均重复3个孔进行试验。结果判定按试剂盒说明书进行，结果为阳性者，鉴别试验判为合格。

3.4.2外观

应为微乳白色混悬液体，久置形成可摇散的沉淀，无异物、

3.4.3装量

依法检查（通则0102），应不低于标示量。

3.4.4渗透压摩尔浓度

依法检查（通则0632），应符合批准的要求。

3.4.5化学检定

3.4.5.1 pH值

应为7.2～8.0（通则0631）。

3.4.5.2铝含量

3.4.5.3游离甲醛含量

应不高于0.24mg/ml（通则3106）.

应不高于100μg/ml（通则3207第一法）。

3.4.6效价测定

按2.2.3.7项进行。4只家兔的Ⅰ型和Ⅱ型出血热病毒的中和抗体滴度均应不低于1：10。

3.4.7热稳定性试验

应由生产单位在成品人库前取样测定。于37℃放置7天.按2.2.3.7项进行效价测定，如合格，视为效价测定合格。

3.4.8抗生素残留量

生产过程中加人抗生素的应进行该项检查。采用酶联免疫吸附法（通则3429），应不高于50ng/剂。

3.4.9无菌检查

依法检查（通则1101），应符合规定。

3.4.10异常毒性检查

依法检查（通则1141），应符合规定。

3.4.11细菌内毒素检查

应小于50EU/ml（通则1143凝胶限度法），

于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为18个月。

应符合生物制品分包装及贮运管理（通则0239）规定和批准的内容。